實(shí)驗方法學(xué)
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?南京建成生物工程研究所
季建平教授主編
東南大學(xué)醫學(xué)院病生教研室
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一、肝素的配制：
市售肝素凍干粉140單位/mg，1克瓶裝，每瓶140，000單位，稱(chēng)取0.1克肝素凍干粉，加生理鹽水5ml，配成2800單位/ml。取50～100μl濕潤管壁，可抗凝人血3～5ml，血液不會(huì )凝固。老鼠血易凝固，所以最好更濃一些?？梢匀?.1克肝素凍干粉，加3ml生理鹽水溶解后，取50～100μl,可抗凝鼠血2～4ml。
肝素抗凝管的制備：取0.1克肝素凍干粉，加2.5ml生理鹽水。取100μl～150μl滴入塑料或玻璃管中，濕潤管壁，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），橫向轉動(dòng)，每隔5～10分鐘轉動(dòng)一次，直至干燥后放入4℃保存，可使2～5ml血液不凝固。
二、血液樣本的收集：
全血根據收集的條件，分成不抗凝和抗凝兩種。同時(shí)，不抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱(chēng)之為血清；抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱(chēng)之為血漿。
????1、不抗凝收集血清:將收集好的全血,靜置1～2小時(shí)，直接低速離心分離出血清待用或保存。
2、抗凝收集血漿:?收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接低速離心分離血漿(也可靜置半小時(shí)左右再低速離心分離血漿)待用或保存。根據不同抗凝劑的性能特征，選擇合適的抗凝劑。實(shí)驗室常用的抗凝劑有肝素的各種鹽、EDTA及枸櫞酸鈉。
選擇抗凝的注意點(diǎn)：
①、每一份樣本所加的抗凝劑的量要一致，同時(shí)所取的全血的量也要盡量一致;
②、收集抗凝全血后一定要輕輕顛倒，充分抗凝，防止部分血液未接觸到抗凝劑而導致凝固;
???????③、抗凝全血收集的血漿相對較多（1ml抗凝全血能分離出0.4～0.5ml血漿）;
???????④、抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時(shí)可能會(huì )出現絮狀渾濁，如有則需要離心去掉渾濁后
用于測定。
????3、全血收集:?收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接定量吸取全血，用冷雙蒸水制備溶血液后用于不同指標的檢測；也可定量吸取全血，轉入EP管，低溫凍存（溫度越低越好），測定之前解凍并按比例加入冷雙蒸水制成溶血液用于檢測。
????4、紅細胞收集：收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，直接離心棄掉血漿，留下層紅細胞，加入3倍體積的生理鹽水，輕輕顛倒混勻，500～1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留沉淀紅細胞,重復2～3次,至上清液無(wú)色為止（洗滌紅細胞）。
??????①、直接定量吸取紅細胞，按比例加入冷雙蒸水制成溶血液待測；
②、定量吸取紅細胞，轉入EP管，立即低溫凍存（溫度越低越好），測定之前解凍，并按比例加入冷雙蒸水制成溶血液用于檢測(解凍后部分紅細胞會(huì )破裂,因此樣本冷凍保存之前必須進(jìn)行定量)。
三、動(dòng)物組織樣本的前處理:
1、取組織塊（0.1g～0.2g）在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，準確稱(chēng)重，放入勻漿管中。
2、按重量(g):體積(ml)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)（推薦使用0.86%的生理鹽水）于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊。
3、勻漿的方式有多種：手工勻漿，機器勻漿，超聲粉碎。
①、手工勻漿：將玻璃勻漿管置于冰水浴條件下，手動(dòng)勻漿，30秒/次，間隔30秒，重復6～8次，制成10%的勻漿液。
②、機器勻漿：用機械式勻漿機（組織搗碎機或內切式勻漿機），8000～10000轉/分，冰水浴條件下，10秒/次，間隙30秒，連續3～5次。（皮膚、肌肉組織等可延長(cháng)勻漿時(shí)間）
③、超聲粉碎：用超聲粉碎機進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。
鏡檢觀(guān)察:取少量組織勻漿作涂片，顯微鏡下觀(guān)察細胞是否破碎，若沒(méi)有則可延長(cháng)勻漿時(shí)間。
4、將制備好的10%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機2500轉/分左右,離心10～15分鐘，取上清液進(jìn)行測定.（測定相應指標的同時(shí)需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售）
四、植物組織樣本的前處理:
????1、勻漿介質(zhì)：
一般采用磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L?pH?7.4)或生理鹽水（0.86%或0.9%）,客戶(hù)可根據樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。
2、組織勻漿液的制備：
①、手工勻漿：取組織塊（0.2g～0.5g）在冰冷的勻漿介質(zhì)中漂洗，濾紙拭干，準確稱(chēng)重，放入勻漿管中，按重量(g):體積(ml)=1:4的比例加入4倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊，將玻璃勻漿管置于冰水浴條件，手動(dòng)勻漿，30秒/次，間隔30秒，重復6～8次，制成20%的勻漿液。
②、機器勻漿：取組織塊（0.2g～0.5g）在冰冷的勻漿介質(zhì)中漂洗，濾紙拭干，準確稱(chēng)重，放入勻漿管中，按重量(g):體積(ml)=1:4的比例加入4倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊，機械式勻漿機（組織搗碎機或內切式勻漿機），10000～15000轉/分，冰水浴條件下，15秒/次，間隙30秒，連續3～5次，制成20%的勻漿液。
③、液氮研磨：取組織塊（0.2g～0.5g）在冰冷的勻漿介質(zhì)中漂洗，濾紙拭干，準確稱(chēng)重，放
入研缽中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，加入液氮研磨至粉末狀（研磨要迅速），加入勻漿
介質(zhì)，充分抽提，制備成20%的勻漿液。
鏡檢觀(guān)察:取少量組織勻漿作涂片，顯微鏡下觀(guān)察細胞是否破碎，若沒(méi)有則可延長(cháng)勻漿時(shí)間。
勻漿上清液的制備：將制備好的20%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機3500轉/分左右,離心10～15分鐘，取上清液進(jìn)行測定（測定相應指標的同時(shí)需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售）。
五、培養細胞的前處理：
1、培養液的測定：
???直接吸取培養液，2500轉/分，離心10分鐘，取上清液進(jìn)行測定。
[注]：一般建議細胞密度在100萬(wàn)個(gè)/ml以上。
2、培養細胞的測定：
①、細胞沉淀的收集：
對于懸浮培養的細胞，通過(guò)離心收集細胞沉淀，將細胞懸液1000轉/分，離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。
對于貼壁培養的細胞，用胰酶將細胞消化下來(lái)加入培養基終止消化，或用細胞刮將細胞刮下來(lái)；制成細胞懸液，1000轉/分，離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。
[注]：一般建議收集的細胞數量在100萬(wàn)個(gè)以上。
②、細胞沉淀的洗滌：
在細胞沉淀中加入0.5～1ml的等滲緩沖液（推薦?0.1mol/L?pH7～7.4磷酸鹽緩沖液或生理鹽水），輕輕顛倒混勻，?1000轉/分，離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀，重復洗滌2～3次。
③、細胞勻漿液的制備：
在細胞沉淀中加入一定量的等滲緩沖液（等滲緩沖液的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般推薦加入0.5ml，細胞密度不小于100個(gè)/ml），混勻，將細胞懸浮于等滲緩沖液中。
[注]：等滲緩沖液推薦使用?0.1mol/L?pH7～7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）或生理鹽水（0.86%或0.9%）
手動(dòng)勻漿：用移液器將細胞懸浮液轉移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水浴條件，手動(dòng)勻漿，?1分鐘/次，間隔30秒，重復6～8次，然后取破碎好的勻漿液進(jìn)行測定（不離心）。
超聲破碎：將細胞懸液置于冰水浴條下，超聲破碎：功率300W，?3～5秒/次，間隔30秒，重
復3～5次；取破碎好的勻漿液進(jìn)行測定（不離心）。
[注]：細胞破碎好以后取出部分勻漿液顯微鏡觀(guān)察，如細胞還未破則增加重復次數；
測定相應指標的同時(shí)需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售。
因為很多裂解液都是蛋白變性劑，因此如果老師測定的指標是酶相關(guān)的，一般不建議用裂
解液來(lái)裂解細胞。
3、培養液及細胞一起處理后測定：
對于懸浮培養的細胞直接進(jìn)行破碎
對于貼壁細胞用細胞刮直接將細胞刮下來(lái)，制成細胞懸液以后進(jìn)行破碎
[注]：一般建議收集的細胞密度在100萬(wàn)個(gè)/ml以上。
手動(dòng)勻漿：用移液器將細胞懸液轉移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水浴條件，手動(dòng)勻漿，30秒/次，間隔30秒，重復6～8次，然后取破碎好的勻漿液進(jìn)行測定（不離心）。
超聲破碎：將細胞懸液置于冰水浴條下，超聲破碎：功率300W，?3～5秒/次，間隔30秒，重復3～5次；取破碎好的勻漿液進(jìn)行測定（不離心）。
[注]：細胞破碎好以后取出部分勻漿液顯微鏡觀(guān)察，如細胞還未破則增加重復次數
測定相應指標的同時(shí)需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售。
六、線(xiàn)粒體及微粒體的提?。?/span>
1、制備10%的組織勻漿（詳見(jiàn)組織勻漿方式）
2、制備線(xiàn)粒體：取10%的組織勻漿，用普通離心機或低溫低速離心機以1000～2000轉/分,離心10分鐘，棄沉淀，取上清液以8000～10000轉/分（低溫高速離心機）離心15分鐘，沉淀物為線(xiàn)粒體。
3、胞漿部分：分離線(xiàn)粒體后的上清液即為胞漿。
4、制備微粒體：取分離線(xiàn)粒體后的上清液即胞漿，以144000g即40000轉/分,離心30分鐘，沉淀物為微粒體。
5、將分離的線(xiàn)粒體或微粒體分別用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成混懸液，用手工勻漿或機器勻漿使線(xiàn)粒體或微粒體破碎，或者用somiprep150型超聲發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒，或者用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次，使線(xiàn)粒體或微粒體破碎，待測酶活力，也可用反復凍融的方法使其破碎，但有部分酶活力會(huì )受影響。
6、制備好的線(xiàn)粒體、微粒體、胞漿部分可根據您的需要分別進(jìn)行各種測定。
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七、線(xiàn)粒體的鑒定（中性紅－詹納斯綠B染色）：
在兩張干凈載玻片中央各滴2～3滴中性紅—詹納斯綠B染液，待其中的酒精蒸發(fā)完全后，用牙簽挑少許沉淀物均勻涂布在一張玻片的染液中；另取上清液一滴，混于另一張玻片的染液中，兩片分別蓋上蓋玻片，染色5分鐘，在高倍鏡下觀(guān)察，被染成亮綠色顆粒即線(xiàn)粒體。
中性紅－詹納斯綠B染色的配制：
A液：取詹納斯綠B（Jana’s?green?B）飽和水溶液（溶解度5.18%）3滴滴入5ml無(wú)水乙醇中，混勻。
B液：取飽和中性紅（Neu－tral?red）水溶液（10mg中性紅溶于150ml蒸餾水中，并用黑紙包好貯冰箱）20～30滴滴入5ml無(wú)水乙醇中，混勻。
用時(shí)將A液和B液混和即成中性紅－詹納氏綠B染液（混和液中的染料不穩定會(huì )在24小時(shí)內發(fā)生沉淀）。
[注]：1、若發(fā)現涂片上有成團的染料可將詹納氏綠B?3滴改成1滴或2滴，而將中性紅20～30滴改為10～20滴。
2、本研究所線(xiàn)粒體制備方法較為成熟，一般不需要染色鑒定。
八、紅細胞中SOD的抽提：
1、采集手指血、或肝素抗凝的靜脈血或動(dòng)脈血50μl[注1]，沖入盛有1～2ml的生理鹽水的帶刻度離心管中,?500～1000轉/分,離心10分鐘。
2、用微量移液器吸去上清液（要吸干凈），留沉淀的紅細胞。
3、加入預冷的雙蒸水0.2ml，混勻（使紅細胞溶解）。
4、加入95%乙醇0.1ml，振蕩30秒。
5、加入三氯甲烷（氯仿）0.1ml置旋渦混勻器充分混勻（抽提）一分鐘。
6、3500轉/分?離心8分鐘。
此時(shí)液體分三層：上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷。若上清有混濁可加入少量固體NaCl后再離心5分鐘，即可澄清。
記錄上清液體積，取5～20μl作SOD測定[注2]。
[注1]：大、小鼠可取內眥血，用玻璃毛細管從內眥部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，將血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干時(shí)溫度要低于80℃），再用移液器取50μl血，作SOD抽提。血量少時(shí)可取10～20μl抗凝全血（做慢性動(dòng)物試驗，在飼養過(guò)程中可以反復取血5～6次）。
[注2]：哺乳動(dòng)物紅細胞中只有銅鋅SOD，沒(méi)有錳SOD。
九、紅細胞膜的制備：
1、?原理和應用?：
?哺乳動(dòng)物細胞是生物質(zhì)膜最方便，最經(jīng)濟的來(lái)源，除來(lái)源廣泛以外，這種細胞還不含任何細胞器，從而可以得到一種純凈的細胞質(zhì)膜。紅細胞血影（ghost）膜主要是采用低滲透處理來(lái)獲得的，在低滲介質(zhì)中，紅細胞膨脹，由雙面盤(pán)狀變成近乎球形，隨后細胞內容物包括血紅蛋白成分因細胞破裂而釋放出來(lái)。最后，通過(guò)離心沉淀技術(shù)可獲得純凈的紅細胞膜（又稱(chēng)紅細胞血影膜）。
2、?儀器和設備：常速離心機和低溫高速離心機
3、?試劑(建成生物工程研究所可訂購)
①、等滲緩沖液（本所有售）
②、低滲緩沖液（本所有售）
4、?實(shí)驗步驟：
①、收集血液并洗滌紅細胞：
將血液標本直接收集到已肝素化的容器內，立即在4℃離心（1500轉/分，10分鐘），用吸管吸去上清液并小心吸去壓積紅細胞上層的白色絨毛狀膜成分（即白細胞等）。將壓積紅細胞用10倍體積的4℃等滲緩沖液或生理鹽水懸浮，依照上述離心條件離心，如此重復2～3次，直至上清液無(wú)色，而且沒(méi)有上層白色絨毛層，用吸管吸除上清液，保留壓積紅細胞。
②、制備細胞膜：
取壓積紅細胞，按1：10的比例加入低滲緩沖液，混合均勻，在4℃環(huán)境中放置20分鐘，由于溶血，細胞懸液由鮮紅色變成透明暗紅色，（將此懸液對著(zhù)日光燈看呈透明）。然后在低溫高速離心機上平衡離心（20000g×30分鐘，一般為8000～12000轉/分×30分鐘，4℃。），取出離心管可見(jiàn)底部有一塊粉紅色沉淀，小心吸去或傾斜離心管緩慢倒出暗紅色上清液。沉淀部分再加入10倍體積的低滲緩沖液，混合均勻后重復離心（20000g×30分鐘或8000～12000轉/分離心30分鐘，4℃）兩次或三次，直至沉淀部分呈現乳白色，棄去上清及離心管底部褐色的纖維蛋白樣沉淀斑，收集白色或淺粉紅色血影膜。
③、血影膜的收集和保存：
將血影膜懸浮于一定體積的低滲緩沖液中，混合均勻，取少量樣品用考馬斯亮蘭法或Lowry氏法或其他方法測定蛋白含量。按需要將血影膜用低滲緩沖液稀釋成一定蛋白含量的懸液，定量分裝到小容器中，分次使用從而避免膜樣品反復凍融，在-20℃，-40℃，-70℃或液氮中貯存備用。
④、血影膜的鑒定：
細胞膜的生物化學(xué)性質(zhì)可用乙酰膽減酯酶、Na+K+-ATP酶活性來(lái)鑒定；其形態(tài)特征可用相
差光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡來(lái)觀(guān)察。
5、?注意事項：
①、紅細胞可來(lái)源于人和其他哺乳動(dòng)物（如大鼠、小鼠、豬、羊、牛、兔等），也可直接購買(mǎi)當地中心血庫（或血液供應站）的全紅細胞，后者可免除其他血細胞的干擾。
②、去除血紅蛋白的程度不僅取決于溶血緩沖液的pH值，而且取決于緩沖液的滲透壓。PH值過(guò)低，滲透壓過(guò)高都會(huì )造成血紅蛋白貯留，血影膜沉淀呈現粉紅色。此外溶液中的二價(jià)離子濃度達1～5mmol/L時(shí)也會(huì )使紅蛋與白明顯貯留。細胞低滲溶血緩沖液的體積比應該在1：10左右，比例過(guò)大或滲透壓過(guò)低則會(huì )增加非血紅蛋白蛋白質(zhì)的損失和膜的破裂，所以，要得到“完整的”無(wú)血紅蛋白的膜則需要注意上述幾點(diǎn)。
③、細胞和膜的貯存時(shí)間要依研究目的而定。通常，要盡快使細胞與血漿分離，并用等滲緩沖液或生理鹽水洗滌。在50%的比容下，懸液能在4℃保存過(guò)夜，但應在24小時(shí)內使用。由于白細胞有較高的蛋白酶活性，對細胞的保存影響較大，因此在制備過(guò)程中應盡可能去除。細胞膜的制備應在當日內完成，4℃貯存細胞或細胞膜會(huì )使得非血紅蛋白的蛋白質(zhì)損失增加，凍存對細胞膜也是有損傷的，如果可能最好是在膜制備完成后就進(jìn)行相應的檢測，即使貯存也應該貯存于低滲緩沖液中，并盡快測試。
④、嚴格控制膜的洗滌次數，次數過(guò)多會(huì )使膜酶活性降低而影響其生化功能。
⑤、一般來(lái)說(shuō)，其他哺乳動(dòng)物紅細胞（如牛、豬、狗、大鼠等）對低滲溶血的表現是相近的，但也不能簡(jiǎn)單地認為所有這些紅細胞在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)等方面都是一致。
十、心肌細胞膜的制備：
1、試劑組成:
試劑Ⅰ液：蔗糖0.1M，EDTA2mM，咪唑1mM，pH7.4。
試劑Ⅱ液：尿素1.3M，咪唑12mM，EDTA?2mM，MgCl2·6H2O?0.1mM，(NH4)2SO47.6mM，pH7.4。
試劑Ⅲ液：咪唑25mM，組氨基酸125mM，EDTA?13μM，pH?6.8。
試劑Ⅳ液：咪唑25mM，組氨基酸50mM，EDTA?0.3μM，pH?6.8。
2、操作方法：
①、將實(shí)驗動(dòng)物擊昏處死后，迅速取出心臟，放入冰冷的生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干水分。
②、10%勻漿濾液的制備：取左心室前壁心肌，去掉心內、外膜，稱(chēng)重（1克左右），加入9倍的Ⅰ液，在冰浴中剪碎，勻漿，二層紗布過(guò)濾。
③、將濾液以10000轉/分?離心20分鐘。
④、在沉淀物及心肌細胞膜中加入5ml試劑Ⅰ洗兩次（每次均需以10000轉/分?離心20分鐘）。
⑤、在沉淀物心肌細胞膜中加10ml試劑Ⅱ混勻后于0℃放置48小時(shí)。
⑥、將沉淀物混懸液以10000轉/分離心?20分鐘，然后將沉淀物用試劑Ⅲ洗兩次。
⑦、將沉淀物即心肌細胞膜懸于約10ml試劑Ⅳ中，置0℃中保存，于48小時(shí)內測ATP酶活性。
十一、血小板的分離：
1、血小板的分離方法一：
①、硅化管的制備：
將硅油與石油醚按3：97的比例配制，取適量于10ml玻璃管內，轉動(dòng)玻管，使硅油均勻地涂布于玻璃管內壁，把每只玻管內的硅油稍倒干凈后放入烤箱，200℃烤1.5～2小時(shí)。
也可直接用干凈的塑料管來(lái)代替硅化管，不需進(jìn)行硅化。
②、血小板的制備：
a、取抗凝全血收集在硅化管內或塑料管內。
b、800轉/分?離心10分鐘。
c、取上層血漿于硅化管或塑料管中，以3000轉/分?離心10分鐘。
d、棄去上層血漿，管底沉淀物即為血小板。
e、用生理鹽水洗三次，每次以3000轉/分?離心10分鐘，去上清留沉淀。
[注]：分離血小板時(shí)所有的玻管及滴管均要硅化，或用塑料試管或塑料滴管。
2、血小板分離方法二：
①、將抗凝全血收集在硅化玻璃管或塑料管內，用生理鹽水，或者Han’s液或含EDTA的緩沖液作等體積稀釋?zhuān)靹颉?/span>
②、取淋巴細胞分離液?2ml，置10ml圓底試管中（分離血小板的玻璃試管均要硅化，或用塑料管及塑料滴管）
③、用滴管將稀釋血沿管壁徐徐鋪于分離液界面上，注意勿沖破界面。
④、以2000轉/分?水平離心15分鐘，取出，可見(jiàn)試管內分四層，第一層為含血小板的血漿層；第二層很薄，是白霧狀或白絮狀，為白細胞層；第三層為分離液層；第四層為紅細胞層。
⑤、用尖毛細滴管直接沿管壁吸取第一層富血小板的血漿層，注入硅化玻璃管或塑料管內。
⑥、以3000轉/分，離心10分鐘，將上層血漿倒去，管底沉淀物即為血小板。
⑦、用生理鹽水或含EDTA的溶液清洗2～3次（每次3000轉/分?離心10分鐘），棄上清留沉淀反復2～3次。
⑧、將血小板記數后備用。
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